Sperm tsRNAs contribute to intergenerational inheritance of an acquired metabolic disorder

huboqiang@gmail.com

作者

周琪:

Figure 1S Zhou Qi.

Figure 1S Chen Qi.

Overview

  1. 建立F0代动物模型
  2. 分别用 HFD(高脂肪饮食)、ND(正常饮食)的F0代精子繁育 F1 代
  3. 注射精子的总RNA,也会引起问题
  4. spermRNA 的亚群
  5. tsRNA 需要修饰才会产生影响

建立F0代动物模型

F0 公鼠,一组 High-fat diet(HFD, 包含60%fat), 一组 ND Normal fat-diet(ND, 10% fat), 喂养半年后,两组出现差别。

这一差别,体现在

  • HFD 组体重从第 10 周其出现差别,且 13 周后这种差别更加显著 Figure S1A
  • 血糖水平 HFD 组更高 Figure S1B
  • 血糖耐受测试(Glucose tolerance test, GTT)中胰岛素水平 HFD 组更高 Figure S1C
  • 胰岛素耐受水平测试(Insulin tolerance test, ITT)中的血糖水平 HFD 组更高 Figure S1D

上。

Figure 1S Figure S1.

分别用 HFD(高脂肪饮食)、ND(正常饮食)的F0代精子繁育 F1 代

现象:

  • 体重没有显著差异 Figure S2A
  • F1 代 Week 7 时,GTT Figure S2B 与 ITT Figure S2C 结果显示,HFD 组后代的 血糖代谢出现了不良影响。
  • F1 代Week 15 时,这些不良影响严重加剧 Figure S2D, E, F

Figure 2S Figure S2.

结论:F0代精子产生的后代,血糖耐受、胰岛素拮抗能力会受到影响.

注射精子的总RNA,也会引起问题

提取 HFD、 ND 组的十个精子的总RNA, 然后注射进入正常的合子中。

现象:

  • 体重没有显著差异 Figure 1A
  • HFD 组后代相比 ND组后代,在 GTT 中,在 15 周时,产生了严重的高血糖不耐受 Figure 1B 以及高胰岛素水平 Figure 1C
  • 而 ITT 测试结果则显示,胰岛素敏感性在 HFD 与 ND 组差别不大 Figure 1D与精卵结合结果不同 Figure S2D, E, F
  • 7 周时, 这一现象就已经出现 Figure 3S

Figure 1

Figure 1, ABCD.

Figure 3S Figure S3.

结论:总 RNA 包含了血糖不耐受的信息,但与胰岛素拮抗无关。
推测:胰岛素拮抗可能和 DNA 甲基化和组蛋白修饰有关。

spermRNA 的亚群

H. Peng, J. Shi, Y. Zhang, H. Zhang, S. Liao, W. Li, L. Lei, C. Han, L. Ning, Y. Cao, Q. Zhou, Q. Chen, E. Duan, A novel class of tRNA-derived small RNAs extremely enriched in mature mouse sperm. Cell Res. 22, 1609–1612 (2012). Medline doi:10.1038/cr.2012.141

smallRNA-seq 测序质量

通过 smallRNA-seq, 检查精子 sncRNA(18-40bp) 的图谱Figure S4

Figure S4 Figure S4.

smallRNA-seq 结果包括 miRNAs 与 tsRNAs

成熟的老鼠精子,除了 miRNA 以外,还具有源于 tRNA 5` 端的 smallRNA(tsRNAs), Figure 1EFigure 1 Figure 1E, F.

tsRNAs 更多的发生了变化

通过比较 HFD 与 ND 精子的 smallRNA, 发现 tsRNAs 相比 miRNA,具有更大比例的变化 Figure S5

即 HFD 的环境更容易影响 tsRNA

Figure S5 Figure S5

PAGE 分离 tsRNA

这里使用 15% PAGE 胶电泳,分离了 HFD、ND 的 15-25nt, 30-40nt, 以及40nt 以上的片段 Figure 2A

Figure 2 Figure 2

HFD ND 两组tsRNAs分离纯度均为 88%

长度在 30-40nt之间的绝大多数是 tsRNA. Figure S7 Figure S7

分别将分离的三组注射进受精卵中

现象:

  • 注射与总RNA 相同浓度的 15-25nt 导致了胚胎死亡
  • 推断是由于浓度过高,基因被过度 knockdown 导致的。

于是稀释了 20x, 发现注射 15-25nt 后不再引起死亡,同时对 HFD也没有影响Figure S8AB。>40nt 同样Figure S8CD

Figure S8AB Figure S8ABFigure S8CD Figure S8CD

然而,注射 30-40nt 则造成了与注射总 RNA 相同的症状:

Figure S9 Figure S9

Figure S10 Figure S10

以上结果说明:

spermRNA 中,引起隔代遗传,在代谢相关最重要的 RNA 亚群,
主要是 30-40nt 长度之间的 tsRNA.

tsRNAs 需要修饰才会产生影响

注射人工合成的未修饰 tsRNAs

实验通过人工合成了占总 tsRNAs 70% 的 tsRNAs, 继而注射在正常受精卵中。

现象:

  • 没有观察到代谢方面的紊乱 Figure 2C, D, E
  • 进一步发现这些合成后的tsRNA相比精子来源的降解更快 Figure 3A

Figure 3

Figure 3

推测:RNA 修饰调控?

液质联用鉴定 tsRNAs 的修饰情况

进一步通过 LC-MS/MS 技术鉴定 tsRNAs 的修饰情况 发现:

  • 10 种 RNA 修饰在精子的 30-40nt tsRNA 中被鉴定了出来Figure S11
  • 其中 m5C 与 m2G 两种修饰在 HFD 精子中比例比 ND 显著上升。Figure 3B
  • 而 15-25nt 的 sncRNAs 在精子却没有显著上升。Figure 3C
  • m5C 已经被报道与 RNA 介导的传代有关。

Figure S11 Figure S11

tsRNA 对转录组、表观组造成的影响:

HFD ND 小鼠胰腺细胞

对注射 tsRNA 的 HFD ND 两组小鼠的胰腺细胞进行 RNA-seq 以及 RRBS 甲基化测序。

结果显示:

  • 差异表达基因主要在 HFD 的代谢通路中出现了下调,并且没有上调Figure 4A
  • 在 ND 与 HFD之间, 有 28 个基因找出了差异甲基化区域。
  • 然而,这些差异甲基化区域与差异表达基因之间没有交集。

Figure 4A

Figure 4A

说明 DNA 甲基化不是 影响胰岛细胞转录组的原因。

HFD ND 小鼠早期胚胎

为了观察这种影响是否在胚胎发育早期即产生, 这里也对 8cell blastocysts 进行了 RNA-seq。

结果发现

  • (869-8cell, 486-Blastocysts, 75-both) 个基因表达,HFD 相比 ND 发生了下调Figure 4B, C.
  • (280-8cell, 285-Blastocysts, 9-both) 个基因表达,HFD 相比 ND 发生了上调Figure 4B, C
  • 下调的主要富集在了代谢通路上,上调基因不富集代谢通路Table S11

Figure 4B, C Figure 4B, C

Table S11 Table S11

tsRNAs 结合位点

统计 tsRNAs 的结合位点,发现:

  • 更多的 tsRNAs 结合位点 富集在基因启动子区域,而不是编码区Figure 4D
  • 在总共1134个可结合 tsRNAs 的启动子上,922个主要在8-cell 中表达,并且 62 个在HFD 与 ND 中表达存在显著差异Figure 4E
  • 这些下调基因主要在 细胞凋亡、自噬、葡萄糖运输等通路Figure S12

Figure 4D, E Figure 4D, E

Figure S12 Figure S12

因此来自精子的 tsRNAs 可能主要是通过转录级联反应,影响胚胎发育过程中代谢相关基因。
下调这一过程,可以影响 F1 后代的基因型。


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